患儿的诊断主要根据血pa测定，患儿血中pa多在20mg/dl以上。经低pa控制后下降。 典型患儿还可显示尿三氯化铁实验，2，4二硝基苯肼试验阳性，但尿液检查不稳定，漏诊率高，只能作参考，不适于作新生儿的筛查。
经典型pku需与高苯丙氨酸血症和bh4缺乏症相鉴别：
1. 高苯丙氨酸血症：患儿血pa浓度在4~20mg/dl，酪氨酸正常或稍低，预后多良好，不需特殊治疗。 如果在正常饮食状态下(蛋白质摄取量为2~3g/kg/日)， 患儿血pa浓度>10mg/dl，或连续数日血pa>7mg/dl，也可以进行低苯丙氨酸饮食治疗。
2. bh4缺乏症(异型pku)：bh4缺乏症约占遗传性高苯丙氨酸血症的1~3%，南方多于北方。 患儿多于婴儿期出现惊厥、发育落后、吞咽困难、肌张力低下或亢进，即使早期进行低苯丙氨酸饮食治疗，血pa浓度降至正常，神经系统损害仍会进行性加重。 目前已发现四氢喋呤合成酶、二氢喋呤还原酶、三磷酸鸟苷还化水解酶等三种酶的缺陷与bh4生成障碍有关。确诊时应进行尿喋呤谱分析、bh4负荷试验及酶活性分析。bh4是苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶和色氨酸羟化酶的辅酶，不仅参与多巴、肾上腺素、5-羟色氨酸的合成， 因此，在治疗中除补充bh4外，尚需补充左旋多巴，5-羟色氨酸，并根据体重、血pa浓度及尿喋呤分析等调节剂量。本病非新生儿疾病筛查范围。