1.雌激素试验
孕激素试验阴性者可以行雌激素试验，以确定孕激素试验阴性原因是否为雌激素水平低下。
方法
口服己烯雌酚1mg/d，共20天，停药后阴道出血为Ⅱ度闭经，表明体内雌激素水平低下。其病因在卵巢、垂体或下丘脑功能不良。若做GnRH垂体兴奋试验后阴道无出血，则可明确子宫性闭经。
2.孕激素试验
判断卵巢有无雌激素分泌可行孕激素试验。
方法
每天肌肉注射黄体酮20mg，用3天，或每天肌内注射10mg，用5天;亦可每天口服甲地孕酮5mg，用5天。
若停药后3～7天出现阴道出血，表明该妇女体内有一定的雌激素，为Ⅰ度闭经;若无出血则为阴性，可能因为体内雌激素水平极低、子宫内膜增生不良，子宫内膜被破坏或缺如(如严重子宫内膜结核病、宫腔粘连或幼稚型子宫等)。
3.FSH、LH、PRL测定
适当时测定血中的各种激素水平，可获得卵巢的功能状态及其影响环节等方面较多的信息，检测血清中FSH、LH、PRL、E2可以鉴别卵巢或垂体性排卵障碍于闭经。如确定卵巢是否已丧失分泌雌激素的能力，或因缺乏促性腺激素而卵巢不分泌甾体激素。用放射免疫法测定促性腺激素，按血清FSH、LH、PRL、E2值来鉴别卵巢或垂体性排卵障碍与闭经(表1)。
(1)PRL
正常值为0～20µg/L，PRL>25µg/L，而FSH/LH水平低，则属高催乳素血症(hyperprolactinemia)，PRL升高时应进一步作头颅X线摄片或CT检查，排除垂体肿瘤。
(2)月经周期中FSH正常值为5～20U/L，LH为5～25U/L
①FSH、LH值>40U/L，可能的情况有：卵巢功能障碍，卵巢早衰，或卵巢发育不全，卵巢不敏感综合征，分泌促性腺激素的肿瘤，17-羟化酶缺乏引起的原发性闭经等。对原发性闭经患者，应作染色体核型分析及分带检查。
②LH>25U/L而FSH值正常、E2偏高或正常，特别是LH/FSH>3时，则可能为多囊卵巢综合征，这时测定雄激素可发现雄烯二酮常上升。
③FSH，LH均<5U/L，示垂体功能减退，病变可能在垂体或下丘脑，而垂体与下丘脑病变的区别，需借助GnRH试验，如结果不明确，则做蝶鞍多向断层摄片或CT检查有无异常，多向断层摄片异常时进行眼底检查。
4.GnRH垂体兴奋试验
GnRH垂体兴奋即LHRH试验，它可以区别下丘脑或垂体性闭经，提示GnRH治疗反应。
方法
3ml生理盐水加入50µg 10肽GnRH静脉推注。分别取注射前后15，30，60和120min的血清测LH。LH峰值出现在用药后15～30min，峰值出现在用药后15～30min且绝对值增加7.5µg/L以上或LH较用药前增高3倍以上为正常反应，垂体功能良好;峰值出现在用药后60～90min为延迟反应;若LH基值低，在6µg/L以下，用药后增加值低于基值2倍为低反应。