灰指甲的诊断常根据患者的病程、症状、指(趾)甲的外观就可以确立，但明确诊断还需要依靠甲的真菌检查。指(趾)甲出现异常并不一定就是灰指甲，许多皮肤疾病和全身性疾病都可能累及指(趾)甲导致指甲变形、变色、增厚、出现白点、表面隆起或凹陷等改变。牛皮癣、甲湿疹、连续性肢端皮炎、雷诺综合征等疾病导致指(趾)甲的改变都与灰指甲类似，由于这些疾病都不是感染性疾病，不能查到病原菌，以此可与灰指甲可以鉴别。
患者自己往往很难分辨指甲改变的原因，医生也不能单凭经验而下诊断，确诊灰指甲最根本的证据就是真菌检查。在患甲上刮取少量碎屑，直接涂片用显微镜观察或者在真菌培养基上培养，真菌感染者可看到真菌的孢子和菌丝或培养出真菌菌落，而非真菌感染者则不能看到或培养出。
无论显微镜检查还是培养基培养，在采取标本时都应刮取尽可能细的患甲细末，有些医院由于条件有限不能进行真菌检查，可将患甲细末寄到大医院去检查，一般不会影响检查结果的正确性。