取甲表面、甲下碎屑、甲组织进行真菌镜检常可发现真菌菌丝和孢子，可以协助诊断，但不能确定致病菌种;将上述组织置于培养基进行培养，经过2-4周，可分离出致病真菌，这样有利于制定治疗方案。病理检查发现菌丝和孢子时可确诊，为诊断甲真菌病的金标准，注意病理检查时同时做真菌培养。
真菌的分离与鉴定、真菌培养检查。刮取碎甲及甲下碎屑，镜下可见真菌菌丝，真菌培养阳性。进行真菌镜检常可发现真菌菌丝和孢子，可以协助诊断，但不能确定致病菌种。病理检查发现菌丝和孢子时可确诊，为诊断甲真菌病的金标准，注意病病理时同时做真菌培养。
灰指甲诊断鉴别
甲癣需与其他皮肤病及全身性疾病引起甲改变的疾病相鉴别，例如银屑病的甲病，先天性厚甲症，先天性白甲症，湿疹，硬皮病，脊髓空洞症，雷诺氏病，连续性肢端皮炎，剥脱性皮炎等均可引起指甲的改变，这些甲病常累及数个指甲且常对称发生。