骨肿瘤的明确诊断必须做到临床、影像学、病理学三结合，同时也不能忽略生化测定的辅助检查意义。病理组织学检查是最后确定诊断骨肿瘤的可靠的检查方法，具体可分为切开活检和穿刺活检两种检查方法。
1、切开活检
切开活检又可分为切取式和切除式两种。顾名思义，切取式是指切取瘤体的一部分，而切除式是完整的切除瘤体，切取式活检手术破坏了肿瘤原有的包围带和软组织间室，组织分离时可扩大肿瘤污染的范围，因此，对于体积不大的肿瘤，最好是选择切除式活检。
2、穿刺活检
穿刺活检是指使用针或套管针闭合穿刺活检，多用于脊柱及四肢的溶骨性病损。穿刺活检具有手术方法便捷、血肿不明显、瘤细胞不容易脱落和播散、避免发生病理性骨折等优点，临床应用广泛。
另外，冰冻切片检查是术中即刻获得病理诊断的快速方法，当冰冻结果和术前诊断出现矛盾时，要特别注意将其与临床症状及影像学结果进行研究，必要时等待石蜡切片做最后的诊断。