先天性尿道下裂是最常见的先天性发育异常之一，常规采用外科手术治疗，手术中尿道重建及阴茎体缝合取决于血供良好的包皮皮瓣[1]。准确认识尿道下裂患者包皮阴茎的血管走行是提高手术成功率的基础。本文将采用先天性尿道下裂兔模型和计算机图像处理技术研究尿道下裂血管变异的分布规律，为临床手术治疗提供重要的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物及实验条件 成年新西兰白兔80只，雌雄比例1∶1，雌兔体重4.7-5.2kg，由山西省农科院畜牧兽医研究所试验兔场提供，清洁级。同期配种后孕兔40只，随机分成A、B、C、D、E 5组，每组8只，均单独笼养。
1.1.2 试剂 非那雄胺片剂，10mg/片，10片/盒。杭州默沙东制药有限公司经美国默沙东公司授权生产(批号：2040109)。
1.1.3 器材及软件 显微镜图像处理系统，photoshop 7.0软件平台，3DMax8.0软件平台。
1.2 动物模型的制备及判定
1.2.1 动物模型制备 新西兰成年兔按雌雄比例1∶1配对，于当日18时同笼饲养，到次日上午8时，完成同期配种，作为计时的第1天，饲养到第19天时，模型组开始予孕兔非那雄胺10mg/(kg·d)口服，每日1次，给药前将药片研成细粉，加蒸馏水适量调成糊状，使用自制喂服器口服给药(表1)，对照组给等量的饲料糊7d。妊娠期间观察孕兔一般情况及胎块发育，孕31-33d自然分娩，幼兔常规饲养。出生后5周观察雄性幼兔阴茎形态、有无尿道下裂;10周观察有无隐睾，分辨尿道下裂的严重程度，同时解剖观察睾丸发育情况。表1 不同诱导时间非那雄胺对雄性幼兔尿道下裂形成的影响
1.2.2 模型尿道下裂严重程度的判定标准 幼兔断乳后将雄性个体挑出，分别用肉眼、放大镜观察各组雄性幼兔外生殖器的形态，根据临床分级方法，可将兔尿道下裂的严重程度分为三级：①比对临床阴茎头型：生殖器突起顶部环行开口的肛门一侧出现裂口;②比对临床阴茎体型：尿道口细长，开口于阴茎腹侧，阴茎向肛门方向弯曲;③比对临床阴囊、会阴型：出生5周时生殖器不易与雌性区别，10周时阴茎突起小，向肛门方向弯曲明显。
1.3 三维重现兔先天性尿道下裂包皮血管
1.3.1 组织连续切片 将切除的兔阴茎立即浸入乙醇甲醛(400mL/L甲醛100mL/950mL/L乙醇900mL)固定液中，固定12h;流水冲洗，丙酮梯度脱水，石蜡包埋，连续切片成5μm厚度，每隔20μm选用一片。每三片按顺序固定在载玻片上。
1.3.2 血管立体构像的计算机重建 40-80倍显微镜下数码成像，分辨率2272×1704，依切片来源个体将图像编号。根据海绵体结构作为定位标准，调整图片中标本的位置与大小，统一存储至硬盘。在photoshop 7.0软件平台上，根据血管的灰度特征，手工提取动脉轮廓线及海绵体轮廓，保存为JPG格式，得到完整的血管分布二维数据。
3DMax8.0软件平台上，按照个体及切片序列，在X、Y轴确定包皮血管位置及直径，用标记重叠的方法分层置入轮廓线，建立Z轴的立体构像。使用平面TUBE化功能完成Z轴的连续化，得到完整的血管3D构像。
2 结 果
2.1 兔先天性尿道下裂模型 给药4d组雄性幼兔生殖器外观与对照组比较未见明显异常，无隐睾;5d组95.5%出现尿道下裂，36.4%发生隐睾;6d组85.2%出现尿道下裂，40.7%发生隐睾;7d组100%出现尿道下裂，73.3%发生隐睾(表1)。参照尿道下裂临床分级方法，63只兔动物模型中30.2%生殖器突起顶部出现裂口，类似阴茎头形;58.7%尿道口细长，开口于阴茎腹侧，类似阴茎体型;11.1%出生5周生殖器不易与雌性区别，出生10周突起向腹侧深度裂开，类似阴囊会阴型(表2)。 表2 不同诱导时间非那雄胺对雄性幼兔尿道下裂形成严重程度的影响
2.2 兔先天性尿道下裂包皮的血管分型 正常新西兰雄兔包皮血管呈单支主干型，尿道下裂阴茎头型组与阴茎体型组包皮血管呈双支主干型，阴囊会阴型包皮血管呈网状无主干型(图1)。
图1 各型尿道下裂包皮血管三维图
A：阴茎头型尿道下裂包皮血管;B：阴茎体型尿道下裂包皮血管;C：阴囊会阴型尿道下裂包皮血管3 讨 论
非那雄胺是一种临床应用广泛的5α还原酶2型同功酶抑制剂，可干扰雄激素代谢途径和正常的细胞信息传递，临床用于良性前列腺增生等的治疗。在实验中利用非那雄胺选择性抑制5α还原酶2型同功酶，进而阻断睾酮转化为双氢睾酮(DHT)，影响雄性胎兔尿道褶正常的融合，导致尿道下裂发生[2]。本研究证实非那雄胺用于诱导雄性胎兔生殖器雌性化的最适剂量为10mg/(kg·d)。
一般认为阴部外动脉为股动脉近端内侧的分支，主干走行明确。该动脉起始于股动脉约占80%，与腹壁浅动脉共干起始于股动脉约占20%，在阴茎以单支主干形分布。 结合临床，先天性尿道下裂术中新尿道成型多取材于包皮、阴茎和阴囊带蒂皮瓣，新尿道外面覆盖的皮肤，也需要血运良好的包皮和阴茎皮瓣。经典尿道下裂手术采用的皮瓣存在多种选择，这些皮瓣在设计时都考虑到阴茎皮肤的血管走行，但治疗成功率并没有因此显著改善，为此有学者认为先天性尿道下裂阴茎皮肤的血供呈不规律分布[3]。
本实验发现正常新西兰雄兔阴茎血管呈单支主干型，血管分支等级清晰，血管直径随分支水平递降，各分支间存在交通支，能够保证阴茎包皮的正常血供。尿道下裂阴茎头型组与阴茎体型组血管呈双支主干型，分布于尿道裂口的两侧，双主干型缺乏交通支，据此可推断由于尿道的完整性与融合时间呈正相关，在孕期使用5α还原酶抑制剂，使部分阴茎尿道停留在尿道嵴尚未融合的分离状态，形成双支主干型。
总之，通过计算机对尿道下裂动物模型阴茎血管的三维重现，分析尿道下裂血管变异的分布规律，探讨不同类型尿道下裂血管分布的特点，为临床手术治疗提供一定的理论基础。